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（郑州拜纳佛生物工程股份有限公司研发中心，河南郑州，450006）
摘要 ε-聚赖氨酸作为一种天然食品防腐剂具有广谱、安全、高效、pH使用范围广、耐高温等特点，广泛受到食品企业的亲赖，但其与其他天然食品防腐剂的抑菌性能对比数据目前文献报道资料较少，导致其不能被广泛应用于食品行业， 此文通过 MIC 实验和抑菌效果实验综合对比了ε-聚赖氨酸、 茶多酚、Nisin 和 壳聚糖这4 种天然防腐剂的抑菌性能，为食品企业使用ε-聚赖氨酸提供基础数据。
关键词： 天然 食品防腐剂； ε- - 聚赖氨酸; ; C MIC 实验；抑菌效果实验
引言
截止2014 年7月，根据《食品添加剂使用标准》规定可添加到食品中的防腐剂有30 多种，可分为化工合成源和天然源。由于化学合成的防腐剂，不易于代谢，存在潜在安全隐患，随着人们对食品安全认识的提高，对化学防腐剂的使用越来越排斥。而天然的食品防腐剂因其具有安全、高效的特点，受到广大消费者和食品企业的亲赖。本文挑选ε-聚赖氨酸、茶多酚、Nisin 和 壳聚糖这4 种天然防腐剂， 对其抑菌效果进行对比研究， 通过 MIC 实验和抑菌效果实验，为食品企业使用天然防腐剂提供基础依据。
1 1 材料与设备
1 1. .1 1 原料与试剂
菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、假单胞菌，菌种由华东理工大学菌种保藏中心提供。
原料：ε-聚赖氨酸 郑州拜纳佛生物工程股份有限公司
水溶性壳聚糖 南通兴成生物制品厂
茶多酚 江苏德和生物科技有限公司
乳酸链球菌素 郑州奇泓生物科技有限公司
培养基原料：
牛肉膏(BR)，胰蛋白胨(BR)，氯化钠(AR)，琼脂
主要仪器与设备：
无菌操作台，恒温培养箱，高压灭菌锅，电子天平，分光光度计 等
2 2 实验方法
2 2 .1 试剂配制
ε-聚赖氨酸 溶液： 用无菌蒸馏水， 分别配制 0.0025%、 0.005%、0.0075%、 0.01%、
0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%的溶液，备用。
水溶性壳聚糖溶液：用无菌蒸馏水，分别配制 0.025%、0.05%、0.075%、 0.1%、0.15%、0.5%、0.75%、1.0%、1.25%、1.5%的溶液，备用。
乳酸链球菌素 溶液： 用无菌蒸馏水，分别配制 0.1%、 0.15%、 0.2%、 0.25%、 0.3%，
备用。
茶 多 酚 溶液： 用无菌蒸馏水， 分别配制0.03%、 0.05%、 0.06%、 0.09%、0.10%、
0.12%、0.15%、0.20%、0.25%的溶液，备用。
假单胞菌培养基：蛋白胨 20.0g，硫酸钾 10.0g，氯化镁 1.4g，琼脂 15.0g，蒸 馏水 1000mL，将各成分加入水中，加热至煮沸 1min，加热的过程中要不断搅拌。 调节 pH7.2，121℃高压灭菌 15min。
营养琼脂 (NA)：牛肉粉 3.0g，蛋白胨 10.0g，琼脂 15.0g，氯化钠 5.0g，蒸 馏水 1000mL，调节 pH7.2，121℃高压灭菌 15min。
2 2 .2 小抑菌浓度 (MIC) 测定：
将活化好的菌种制备成 0.5 麦氏浓度菌悬液，取 1ml 制备好的菌悬液加到无菌的平板中，倾注冷却至 45℃的营养琼脂培养基约 15ml，并混入 2ml 保鲜液，轻轻晃动平板，使之混合均匀，每个浓度做两个平行平板，待凝固后，倒置培养12-24h。查验无菌落生长的保鲜剂浓度作为 MIC，MIC 值越低表明抗菌效果越好。
2 2 .3 抑菌效果实验
采用滤纸片法评价抑菌效果：
1 将滤纸（1.5mm 厚）打孔，直径 6mm，160℃ 干热灭菌2h；
2 将活化好的菌种制备成0.5麦氏浓度菌悬液，备用。
3 平板中注入1ml菌悬液，倾入冷却至45℃的营养琼脂培养基约15ml，轻轻晃动平板，使之混合均匀；
4 无菌条件下，将滤纸片置于保鲜液中浸泡 1min，取出凉干，每一 个平皿均匀放6个滤纸片，其中1个为空白对照。每种抑菌剂做三个平行板；
5 将培养皿倒置于恒温箱中，30℃条件下培养 24h；
6 使用游标卡尺准确测量抑菌 圈的直径，并记录结果。
3 3 结果与讨论
3 3 .1 小抑菌深度 (MIC
抑菌剂 0(空白) 1 2 3 4 5
ε-聚赖氨酸 0% 0.0025% 0.005% 0.0075% 0.01% 0.02%
+ + - - - -
壳聚糖 0% 0.025% 0.05% 0.075% 0.1% 0.15%
+ + + + - -
茶多酚 0% 0.03% 0.06% 0.09% 0.12% 0.15%
+ + + - - -
Nisin 0% 0.1% 0.15% 0.2% 0.25% 0.3%
表 3-1 四种防腐剂对大肠杆菌的小抑菌浓度
抑菌剂 0(空白) 1 2 3 4 5
ε-聚赖氨酸 0% 0.0025% 0.005% 0.0075% 0.01% 0.02%
+ - - - - -
壳聚糖 0% 0.025% 0.05% 0.075% 0.1% 0.15%
+ + - - - -
茶多酚 0% 0.03% 0.06% 0.09% 0.12% 0.15%
+ + - - - -
Nisin 0% 0.1% 0.15% 0.2% 0.25% 0.3%
+ - - - - -
表 3-2 四种防腐剂对金黄色葡萄球菌的抑菌浓度
抑菌剂 0(空白) 1 2 3 4 5
ε-聚赖氨酸 0% 0.0025% 0.005% 0.0075% 0.01% 0.02%
+ - - - - -
壳聚糖 0% 0.025% 0.05% 0.075% 0.1% 0.15%
+ + - - - -
茶多酚 0% 0.03% 0.06% 0.09% 0.12% 0.15%
+ + - - - -
Nisin 0% 0.1% 0.15% 0.2% 0.25% 0.3%
+ + + + + +
表 3-3 四种防腐剂对假单胞菌的小抑菌浓度
注：+表示有菌落，-表示无菌落
从以上三个表可以看出， 各种抑菌剂对三种菌的抑制效果各不相同， ε-聚赖氨酸 、壳聚糖、茶多酚对大肠杆菌的小抑菌浓度分别为 0.005%、0.1%、0.09%。ε-聚赖氨酸 、壳聚糖、茶多酚和 Nisin对金黄色葡萄球菌的小抑菌浓度分别为0.0025%、0.05%、0.06%、0.1%。ε-聚赖氨酸 、壳聚糖、茶多酚对假单胞菌的 小抑菌浓度分别为 0.025、0.05%、0.06%。
由表 3-2 所见，nisin 金黄色葡萄球菌有较强的抑菌作用，对葡萄球菌的小抑菌浓度应在小于 0.1%，而对假单胞菌、大肠杆菌无明显作用。ε-聚赖氨酸、 茶多 酚和 壳聚糖都是广谱抑菌剂，Nisin 只对革兰氏阳性细菌有抑制作用，而对革兰氏阴性如：大肠杆菌和假单胞菌等无抑制效果。
3.2 抑菌浓度
ε-聚赖氨酸对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和假单胞菌均有表现出较强的抑制作用，浓度为 0.02%时 ε-聚赖氨酸对大肠杆菌、假单胞菌抑菌作用较弱，浓度在0.04%和 0.06%之间时，抑制作用远高于浓度为 0.02%时的效果。浓度在0.04%~0.06%之间时，各浓度之间的抑菌效果差异不明显,说明已达到 抑菌浓度。壳聚糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有较强的抑制作用都有明显的抑菌作用，且抑菌效果随浓度增加面加强，当其浓度达到 1.0%左右时，抑菌效果随浓度增加增加效果不明显。茶多酚对三种菌均表现出较强的抑制作用，在浓度为 0.05%时茶多酸对大肠杆菌和假单胞菌已有较强的抑制作用， 对金黄色葡萄球菌 抑制不明显。 随浓度增加，茶多酚对金黄色葡萄球菌的抑制效果显著增加，而对 别外两株菌的抑制效果变化不显著。
Nisin 对大肠杆菌的抑菌效果在浓度由 0.02%增加至 0.04%过 程中存在加大跃迁；浓度在 0.04%~0.10%之间时，抑菌圈直径增加缓慢；Nisin 对大肠杆菌和假单胞菌无抑菌圈产生，说明 Nisin 对这两种菌无抑制作用，因为这两种菌为革兰氏阴性菌，而 Nisin 只能够抑制革兰氏阳性菌。
4 4 结论
本实验研究了ε-聚赖氨酸、 壳聚糖、 茶多酚和 Nisin 四种天然保鲜剂对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和假单胞菌的抑制效果，通过 MIC 实验和抑菌效果实验发现四种保鲜剂对三种代表菌的抑制效果各不相同，其中ε-聚赖氨酸、壳聚糖和茶多酚表现出较好的抑菌效果，Nisin 较差。
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